呕吐毒素检测试剂盒

说明书

1、概述

脱氧雪腐镰刀菌烯醇又称呕吐毒素，由禾谷镰刀菌产生，常出现在玉米、小麦、大麦等谷物中，可引起猪的呕吐反应，故得名呕吐毒素。我国谷物中DON残留限量标准为1.0mg/Kg。

2、实验原理

本试剂盒采用间接竞争一步法。在酶标板中同时加入标准品（或样本）、酶标二抗、呕吐毒素抗体，酶标板上包被的抗原与加入的标准品（或样本）中的抗原竞争结合加入的呕吐毒素抗体，同时酶标二抗与呕吐毒素抗体结合。用TMB底物显色，样本吸光值与其残留物呕吐毒素浓度呈负相关，与校准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中呕吐毒素的含量。

3、技术指标

3.1检测时间：20分钟（不包括样品前处理）

3.2检测范围：100ppb—8100ppb

3.3试剂盒灵敏度：1ppb

3.4交叉反应率：

   呕吐毒素…………………………………100%

3.5样本最低检测限

   饲料、谷物………………………………100ppb

4、试剂盒组成

酶标板…………………………………………2x48孔

标准品…………………………………………6x1ml/瓶

0、 100、 300、 900、 2700、 8100 （ppb）

(注意：因为谷物样品在前处理过程中1:100倍稀释，标准品实际浓度为标定的1/100，所以样品浓度无需校正。)

 酶结合物…………………………………………1x7ml/瓶

抗体溶液…………………………………………1x7ml/瓶

底物溶液…………………………………………1x12ml/瓶

终止液……………………………………………1x10ml/瓶

样本稀释液………………………………………1x50ml/瓶

浓缩洗涤液（10x）………………………………1x50ml/瓶

说明书……………………………………………1份

5、所需仪器和试剂

 5.1仪器：酶标仪、离心机、涡旋仪、恒温箱、天平（感量0.01g）、刻度移液管、量筒、称量勺等；

5.2微量移液器：单道20-200VL、100-1000VL、多道300VL；

5.3试剂：无水乙醇、去离子水。

6、试剂配制

 6.1洗液工作液（1x）：用去离子水将浓缩洗涤液（10x）按1:9体积比进行稀释。即1份浓缩洗涤液（10x）+9份去离子水，用于酶标板的洗涤。洗液工作液在4℃环境下可保存一个月。

6.2样品提取液：40%乙醇溶液，取纯乙醇用去离子水按6:4体积比进行配置（即6份去离子水+4份纯乙醇）

7、样本前处理

 7.1谷物、饲料等样本前处理

 （1）称取5.00±0.05g的样本，加入25ml 40%乙醇溶液(样品提取液)，震荡2min；

（2）4000rpm离心5min；

（3）取50ul上清加入950ul样本稀释液，漩涡，混匀；

（4）取混匀后的溶液50ul进行检测。

稀释倍数1倍

8、酶联免疫操作步骤

8.1回温：实验前将各种试剂移至室温（20-25℃）平衡至少30分钟，按前述方法配置试剂，备用。

8.2取反应孔：按需要取出微孔条及板架，将不用的微孔条放回铝箔袋，保存于2-8℃。

8.3加样：向对应孔加标准品/混匀的样品50ul，标准品/样品建议做重复，然后向每个孔加入酶结合物50ul和抗体50ul，轻轻震荡混匀，25℃避光反应15分钟。

8.4洗板：甩干孔内液体，用稀释好的洗液工作液250ul/孔洗板4次，每次浸泡30秒，最后一次洗完板后，在吸水纸上拍干。

8.5显色：每孔加入底物溶液100ul，轻轻震荡，25℃避光显色5分钟。

8.6终止：每孔加入终止液50ul，终止反应（此时蓝色应转为黄色），终止液加入顺序应与底物液加入顺序一致。

8.7读数：用酶标仪在450nm波长下测定各孔的吸光度值（OD值），在加入终止液后5分钟内进行检测。（建议用双波长450/630nm检测）

9、操作要点

9.1为了提高检测结果的准确性，建议标准品及样本均点双孔测定。每次检测均需做标准曲线。

9.2加样：每次加标准及样本时，请更换一次性的干净吸头，避免交叉污染。加样时应尽量轻缓，避免起泡，将样本加于板孔底部，切勿沿孔壁加样，单次实验建议不要超过48孔，单次加样时间最好控制在10分钟内，如样本数量多，最好使用排枪加样。

9.3孵育：为防止样本蒸发或污染，避免阳光照射，孵育过程中酶标板必须覆上遮挡物，实验过程中酶标板应避免处于干燥的状态。

9.4洗板：洗板过程非常重要，不充分的洗涤容易造成假阳性。酶联免疫分析中的重现性很大程度上取决于洗板的一致性，请严格按照说明书要求洗板。

9.5显色：当加入底物溶液后，每隔3分钟可观察一下显色情况，当标准品前3-4孔有明显梯度蓝色，后3-4孔显色不明显时，即可加入终止液终止反应。反应孔颜色的深浅与实验温度及显色时间成正比，即实验温度越高、显色时间越长颜色越深。

9.6底物溶液应为无色或浅蓝色，如果颜色严重变深说明已经变质，应当弃用。底物溶液易受污染，请避光妥善保存。

9.7实验环境、检测试剂及样本的最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致试剂盒吸光度值和灵敏度发生变化，影响检测结果。当0标准的吸光度值小于0.5时，表明该试剂盒可能变质失效。

10、结果分析

10.1百分吸光度值的计算：获得的每个浓度标准品和样本的吸光度值（B）除以第一个0标准品的吸光度值（B0），再乘以100%。

即

B

百分吸光度值（%）=----------×100%

B0

B：标准品或样本的平均吸光度值

B0：0标准品的平均吸光度值

标准曲线的绘制与计算：以标准品的百分吸光度值为纵坐标，以标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光度值代入标准曲线中，读出样本对应的浓度，再乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。

11、储存条件及有效期

11.1未开封的试剂盒避光保存于2-8℃，有效期为12个月。

11.2 酶标板开封后极易受潮变质，放于带有干燥剂的铝箔袋中2-8℃密封防潮保存，可保存一个月。（建议开封后一月内用完）

提示：本产品检测结果仅供参考，如需确证，请参照国家相关标准方法执行。